仙人掌肉質(zhì)莖中含有多種生物堿, 其中主要為酪胺、N- 甲基酪胺、3- 甲氧基酪胺、β- 苯乙胺、大麥芽堿等酪胺更是仙人掌中生物堿的重要成分。接下來(lái)給大家介紹用CO?培養(yǎng)箱從仙人掌里面提取生物堿時(shí)所需設(shè)備及實(shí)驗(yàn)方法如下：

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：HL-60細(xì)胞

   提取實(shí)驗(yàn)所需儀器：熒光倒置顯微鏡、凈化工作臺(tái)、1640培養(yǎng)基、高速冷凍式離心機(jī)、實(shí)驗(yàn)室超純水器、立式壓力蒸汽滅菌器、酶標(biāo)儀、離心沉淀器、遠(yuǎn)紅外干燥箱、恒溫加熱磁力攪拌器、轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電熱恒溫水浴鍋、循環(huán)水式真空泵、紫外分光光度計(jì)、電熱套、圓底燒瓶、蛇形冷凝管、布氏漏斗、分液漏斗、分析天平、容量瓶、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、比色管。

   實(shí)驗(yàn)試劑：Sigmo MTT試劑、臺(tái)盼藍(lán)染液、1640培養(yǎng)液、乙醇、甲醇、1 mol / L的硫酸,、濃氨水、改良碘化鉍鉀試劑、酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、KB r粉末。

方法

    1、仙人掌中生物堿的提取分離與精制將仙人掌粉碎，取細(xì)粉20g，在條件為：乙醇濃度95 % 、物料比1∶15 、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間3 h的條件下，乘熱抽濾，濾渣再于同一條件下提取2h，乘熱抽濾，合并濾液，濾液減壓于水浴鍋中濃縮，再將濾液放冷析出結(jié)晶，得粗提物。向粗提物中加入適量1 mol / L 的硫酸, 形成酸水液和沉淀, 濾去酸水液中的沉淀, 加入適量的濃氨水調(diào)至pH 值9 ～10 。然后用分液漏斗萃取3-4h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮后抽濾，得總生物堿。

   2、仙人掌中生物堿類物質(zhì)的鑒定

   化學(xué)法檢查：將提取的總生物堿液，用1%的鹽酸萃取，得鹽酸溶液10毫升，分為四個(gè)小試管儲(chǔ)存，分別在四個(gè)小試管中加入改良碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸試劑，觀察各試管中的變化。

   薄層層析檢查：取總生物堿少許—丙酮—甲醇（6∶1∶1）溶解, 用毛細(xì)管點(diǎn)樣于預(yù)先制備好的硅膠GF254 板上, 上行法展開。當(dāng)展開劑跑至硅膠板前沿約1～2cm 處時(shí), 取出, 揮干溶劑。先觀察熒光, 后用改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色,觀察斑點(diǎn)位置及顏色，同時(shí)用酪胺標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。

   3、白血病
   HL-60細(xì)胞培養(yǎng)人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加青霉素100μg·mL-1，鏈霉素100μg·mL-1，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃飽和培養(yǎng)。
   4 、總生物堿的抑瘤實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作把總生物堿提取物用牛皮紙封好口，離心管與培養(yǎng)瓶放在鋁制盒里，和替補(bǔ)頭一起在壓力蒸汽滅菌器里滅菌，20分鐘后放入遠(yuǎn)紅外干燥箱干燥后備用。

   5、接種細(xì)胞

   取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HL-60細(xì)胞，用離心機(jī)1000rmp離心10min后，小心棄去上清液，分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105 個(gè)/ml的單細(xì)胞混懸液，每孔150ul接種于96孔培養(yǎng)板中，置5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃的培養(yǎng)過夜，備用。

   6、加藥培養(yǎng)
   將提取物制備成10個(gè)不同濃度劑量，分別為：5，10，20，50，100，200，400，600，800,1000ug/ml。

   7、再將不同濃度的提取物

50ul分別加入各接種了HL-60細(xì)胞的試驗(yàn)孔中，平行5孔

   8、設(shè)置只加細(xì)胞，

不加藥液的對(duì)照孔和只加培養(yǎng)液的空白孔,均平行5孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h

   9、熒光倒置顯微鏡觀察法測(cè)定
在加藥培養(yǎng)前和加藥培養(yǎng)后的24、48、72h于熒光倒置顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組與空白組不同時(shí)期細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)。
   10、MTT法檢測(cè)
取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，用離心機(jī)1000rmp離心10min后，小心棄去上清液，分別與0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml的單細(xì)胞混懸液，每孔150ul接種于96孔培養(yǎng)板中，并設(shè)空白對(duì)照孔，只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞，置5% CO2，37℃的CO2培養(yǎng)箱中過夜。
   11、換液，加入受試藥物，50μl/ 孔，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)重復(fù)，細(xì)胞在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 8 h 后，加入MTT20μl/ 孔(5mg/ml)，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中、置5% CO2 反應(yīng)4h。
   12、小心吸去上清液，加入DMSO 溶解，每孔150μl,平板搖床上振搖5min。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570nm 處測(cè)定每孔的OD值，測(cè)時(shí)須減去空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
   13、計(jì)算細(xì)胞存活率及藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率。
細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100% 細(xì)胞抑制率(%)= （1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

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